El delicado arte del cultivo de células

En esta página informativa se trata una serie de tipos de cultivos de células, parámetros
y equipos para cultivos de células eucariotas de vertebrados e invertebrados. Se mencionan brevemente cultivos de células vegetales, p. ej., de arabidposis.

Los cultivos de seres procariotas, que se cultivan por lo general en incubadores microbiológicos, no constan en esta entrada. 

Investigación farmacéutica, investigación médica, medicina reproductiva (fertilización in vitro), medicina regenerativa (trasplantes, prótesis, ingeniería de tejidos), etc. En laboratorios de cultivo de células de todo el mundo se utilizan distintos cultivos de células para satisfacer diversas funciones.

UNA VISIÓN GENERAL DEL CULTIVO DE CÉLULAS 

En este punto resulta útil la siguiente explicación de los términos "en cristal o en un tubo
de ensayo" (in vitro) y "fuera de la vida" (ex vivo).

Utilizamos el término "in vitro" para el cultivo celular y de tejidos fuera del organismo en condiciones fisiológicas artificiales. Por lo general, se lleva a cabo en recipientes, placas
y bandejas para el cultivo de células, con medios de cultivo como RPMI 1640, DMEM o F-12 de Ham y con una temperatura y humedad simuladas enincubadoras de CO2 o incubadoras de CO2/ O2. Algunos cultivos pueden existir durante un tiempo ilimitado, como el caso de la línea celular inmortalizada HeLa.

Ex vivo denomina procesos por los que se extrae material vivo, p. ej. sangre, para su tratamiento y que, tras su cultivo en una incubadora de CO2, se devuelve sin demora al cuerpo. De esta forma, p. ej., se introducen genes en células mediante la terapia genética ex vivo.

1. Cultivos primarios, líneas celulares y estirpes celulares

Los cultivos primarios se generan a partir de células, tejidos y órganos que se extraen directamente de un organismo.

Tras el primer subcultivo (cultivo secundario) o el primer traslado, se genera una línea celular cuya vida útil limitada no se corresponde con el proceso de envejecimiento natural del organismo vivo.

Los cultivos primarios de tejido normal necesitan un sustrato fijo para su adhesión (cultivos adherentes), mientras que las células tumorales pueden cultivarse en suspensión.

Las células con propiedades específicas derivadas de un cultivo primario o línea celular por medio de la selección o la clonación se denominan estirpes celulares.

2. Células inmortalizadas

La posibilidad de la división celular ilimitada distingue a las células inmortalizadas. Esta "inmortalidad" se genera mediante la infección con virus, p. ej., el papilomavirus HPV18 (células HeLa), mediante la transfección con genes o proteínas inmortalizados y mediante la tecnología de hibridomas. Aquí se fusionan linfocitos B productores de anticuerpos con células de mieloma (células tumorales) para producir anticuerpos monoclonales.

Una de las líneas celulares permanentes más conocidas es la línea celular HeLa. Se extrajo en la década de los 50 del carcinoma de cérvix de la americana Henrietta Lacks: fue la primera vez que se obtuvo una línea celular inmortalizada a partir de una célula humana. Desde entonces se han cultivado más de 50 toneladas de células HeLa en laboratorios de todo el mundo. La ciencia agradece a la robusta célula HeLa miles de experimentos y resultados.

Pero la línea celular HeLa no es la única línea celular permanente establecida gracias a la investigación. Desde entonces, la lista incluye más de 4.000 registros de líneas celulares humanas y animales. Entre ellos se encuentran las células Vero (línea celular de un mono verde africano), las células HEK-293 (línea celular de un riñón de embrión humano) y las células K562 (la línea celular más antigua de leucemia humana).

3. Células adherentes y cultivos en suspensión

Las células adherentes como, p. ej., los cultivos de células HEK 293 y CHO (ovario de hámster chino), crecen y se reproducen únicamente cuando se adhieren a la superficie de recipientes de cultivo. 

Como cultivo de células bidimensionales, se propagan sobre su soporte, como máximo una capa unicelular (monocapa), hasta que se produzca la inhibición de la unión celular (confluencia) y acabe por morir el cultivo. En las incubadoras de CO2 se utilizan botellas rodantes para el aumento de la superficie de crecimiento. También se usan agitadores para mejorar las condiciones de crecimiento de los cultivos celulares adherentes. Ambas posibilidades sirven para el escalado. Para mantener los cultivos en la fase de latencia se requiere un traslado regular (la transferencia a nuevos recipientes con un medio de cultivo fresco).

Los cultivos en suspensión o los cultivos no adherentes son células animales, humanas o vegetales que se reproducen en un medio de cultivo líquido sin adherirse al recipiente de cultivo. Sólo determinados tipos de cultivos son adecuados para un cultivo en suspensión, p. ej., las células NS0 (mieloma de ratón), que se utilizan tanto en investigación biomédica como en la producción de proteínas terapéuticas. En las incubadoras de CO2 se produce el escalado de cultivos en suspensión, p. ej., en frascos agitadores oagitadores de rotación.

4. CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES 

Las células vegetales pueden cultivarse también in vitro. Los cultivos se generan a partir del explanto de hojas, tallos, tubérculos, ovarios, anteras o raíces. En cultivos fotosintéticos activos debe garantizarse que exista una intensidad luminosa y un espectro de luz adecuados, p. ej., en cámaras de crecimiento de plantas con lámparas de crecimiento del tipo Fluora® o lámpara arabidopsis. En cámaras de crecimiento de plantas se utilizan también botellas rodantes, p. ej., para el escalado, así como agitadores de rotación. 

Algunas fuentes de referencia

  • DSMZ Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 
  • ATCC American Type Culture Collection
  • ECACC European Collection of Authenticated Cell Cultures 

LA NECESIDAD CRECE

Diversos análisis de mercado presentan un sólido crecimiento en el mercado de cultivos celulares a nivel mundial, de entre 30 y 35 mil millones de euros hasta el año 2023.  Aquí se incluyen los ámbitos de aplicación de la industria farmacéutica, la biotecnología, la investigación sobre el cáncer y la ingeniería de tejidos, los equipos de laboratorio como autoclaves, biorreactores, centrifugadoras y sistemas de filtración, así como consumibles como medios y antibióticos libres de suero.  Sólo el mercado de cultivos celulares 3D crecerá en más de 2.000 millones hasta 2019.

En comparación con los cultivos 2D descritos, los cultivos celulares 3D muestran una gran similitud con las características morfológicas, metabólicas y funcionales in vivo.  Los sistemas de cultivos 3D se dividen en sistemas sustentados por una matriz y sin matriz. Estos cuentan con un potencial único como sistema de pruebas y de investigación para estudios médicos y farmacéuticos.  Existen modelos de tumores en 3D, modelos de piel en 3D, modelos de intestinos en 3D y modelos de hígados en 3D.

Los sistemas de cultivos de células 3D se utilizan en el desarrollo de medicamentos, la investigación biológica y médica, en los ámbitos de la medicina regenerativa y de la ingeniería de tejidos, en el análisis medioambiental y para sustituir la experimentación en animales.

Los biomedicamentos cuentan también con un enorme potencial de negocio. 

Los principios activos farmacéuticos producidos con la ayuda de células de mamíferos, p. ej., el medicamento Herceptin contra el cáncer de mama a partir de la línea celular CHO, son cada vez más abundantes.  Para ello se utilizan grandes biorreactores o tanques de fermentación.  En fermentadores con más de 10.000 litros de volumen se encuentran, por lo general, unos pocos kilos de principio activo. 

Uno de los ejemplos más prósperos para el cultivo de células a gran escala es la producción de la epoetina α y β (eritropoyetina-EPO) por medio de un subclón de una línea celular CHO modificado genéticamente.  EPO es una hormona proteica humana para la formación de glóbulos rojos que los médicos prescriben principalmente a los pacientes renales y de cáncer. Con una facturación anual de alrededor de 10.000 millones de euros, es el biomedicamento líder a nivel mundial.  

También los anticuerpos monoclonales que provienen de un único linfocito B original y que son, por tanto, idénticos y muy específicos, se cultivan en grandes cantidades en incubadoras de CO2. En la medicina se utilizan tanto para el diagnóstico como para la terapia. 

LABORATORIO DE CULTIVO DE CÉLULAS, EQUIPOS DE LABORATORIO Y MEDIOS AUXILIARES 

Empezando por la planificación del laboratorio, la instalación del laboratorio, el equipamiento con equipos de laboratorio, los recipientes de cultivo, los medios de cultivo y hasta las pipetas, es necesario observar la protección del producto, personal y del medio ambiente así como las especificaciones de las BPL o GMP.

El delicado arte del cultivo de células

PLANIFICACIÓN DEL LABORATORIO Y EQUIPAMIENTO DEL LABORATORIO 

Los bancos de pruebas de seguridad biológicos y las incubadoras de CO2 deben encontrarse en proximidad uno del otro. Las puertas de la incubadora de CO2 deben abrirse hacia el puesto de trabajo. Esto es especialmente útil en el caso de un traslado dado que la extracción y la carga de los recipientes de cultivo puede realizarse de forma rápida y por el recorrido más corto. 

También es importante la elección correcta del lugar de instalación en el laboratorio. Debe evitarse la radiación solar directa sobre los equipos de laboratorio así como los lugares de instalación con fuertes movimientos de aire, p. ej., en la cercanía de puertas o bajo aires acondicionados de techo. Además, deben respetarse las indicaciones del fabricante sobre todas las distancias a la pared. Es evidente que todos los equipos de laboratorio se instalan con un nivel de burbuja. 

Otros equipos de los laboratorios de cultivos celulares son, p. ej., centrifugadoras, frigoríficos, congeladores, contadores de células, criostatos, microscopios, pipetas y soportes para pipetas. 

Cultivo de células en la incubadora

MEDIOS AUXILIARES

Recipientes de cultivo

Las placas de Petri, los frascos T, las placas microtituladoras, p. ej., de conformidad con los estándares de SLAS (Society For Laboratory Automation And Screening, antes estándar SBS) para cribados (HTS de la investigación de principios activos), láminas para cultivos celulares 3D y botellas rodantes constituyen sólo una pequeña selección de los posibles recipientes de cultivo para el cultivo de células adherente y en suspensión o por goteo. 

Medios de cultivo 

Los medios de cultivo son especialmente importantes en el cultivo de células ya que suministran nutrientes, factores de crecimiento y hormonas, pero también desempeñan un papel decisivo en la regulación del valor de pH y de la presión osmótica. Existen tres tipos de medios: Basal Medium Eagle (BME), medio con suero reducido y sin suero, p. ej., para hibridoma, CHO, queratinocitos y células de insectos.

Otros ejemplos son: RPMI-1640, Dulbecco’s Modified Eagle Medium o F12 de Ham. Para el crecimiento y el almacenamiento a corto plazo (unos minutos) se utilizan Balanced Salt Solutions como las sales de Hanks o de Earle. 

PARÁMETROS FUNDAMENTALES 

VALOR DE PH Y CONCENTRACIÓN DE CO2 

La mayoría de las células de mamíferos se sienten cómodas con un pH de 7,4. Las líneas celulares transformadas prefieren valores de pH ligeramente menores, entre 7.0 y 7.4, mientras que las líneas celulares de fibroblastos prefieren valores de pH ligeramente alcalinos, entre 7.4 y 7.7. Las líneas celulares de los insectos, p. ej., Sf9 y Sf21, tienen un pH óptimo de 6.2. 

En un valor de pH existe un frágil equilibrio entre el CO y el bicarbonato HCO3 disueltos en el medio y la concentración de CO2 en la atmósfera. Para ello, los medios se amortiguan, p. ej., con HEPES orgánico o un amortiguador de CO2 con base de bicarbonato. Las oscilaciones en la concentración de CO2 de la atmósfera resultan en modificaciones indeseadas del valor de pH en el cultivo de células. Por ello, en las incubadoras de CO2, en función del cultivo de células, debe mantenerse una concentración de dióxido de carbono de entre un 5 y un 7 % vol. 

Algunos fabricantes de incubadoras de CO2 ofrecen en sus manuales de instrucciones información útil sobre la dependencia de los valores de pH de los medios en función de la concentración de CO2 en la incubadora. 

Medios de comunicación culturales

Ejemplo: si se mide un pH de 7.2 en un medio, amortiguado con 2,20 g NaHCOpor litro, la concentración de CO2 en el entorno del medio será de 8 % vol.

La concentración de CO2 de las incubadoras se miden con un sensor IR (sensor de infrarrojos) o con un detector de conductividad térmica. 

NORMOXIA, HIPOXIA E HIPEROXIA  

La concentración de oxígeno del aire es del 21 % vol. (normoxia). El tejido adiposo presenta una concentración de oxígeno de alrededor del diez al quince por ciento; en la médula, es de entre el seis y el siete por ciento. Por el contrario, el tejido delicado, como los pulmones o la retina, requiere condiciones hiperóxicas (21-90 % vol.). 

Para alcanzar concentraciones de oxígeno por debajo y por encima del 21 % vol, se requieren incubadoras de CO2/O2. Encontrará más información en nuestra entrada de blog sobre normoxia e hipoxia

TEMPERATURA Y HUMEDAD DEL AIRE 

Todos los procesos celulares dependen de la temperatura. La temperatura óptima para el cultivo de células de mamíferos es 37 °C, mientras que para el cultivo de células de insectos, peces y anfibios se necesitan por lo general entre 25 y 28 °C. 

Los valores de humedad elevados en las incubadoras de CO2 reducen al mínimo el índice de evaporación de los medios de cultivo y consiguen, por tanto, la concentración osmótica deseada (osmolaridad). 

Existen distintas opciones para la regulación de temperatura y la humidificación de incubadoras de CO2

Una incubadora de CO2 de alta calidad ofrece las condiciones de crecimiento ideales para cualquier tipo de célula: 

¡Aquí encontrará más información sobre el cultivo de células!

LIBRO BLANCO DEL CULTIVO DE CÉLULAS EN LA INCUBADORA DE CO

Desde factores interiores como la temperatura, el contenido de CO2, el contenido de oxígeno o la humedad pasando por los materiales de la incubadora y su limpieza hasta la validación de la incubadora: un diseño de incubadora especialmente concebido comprende, controla y regula numerosos parámetros distintos. Todos los criterios desempeñan un papel en el cultivo de tejidos en las incubadoras de CO2. Todos los criterios son fundamentales para el cultivo de células.  

El desarrollo cualitativo de las incubadoras de células ha sido constante, a fin de alcanzar unos objetivos concretos: 

  • cumplimiento del valor nominal 
  • máxima precisión
  • constancia 
  • controlabilidad 
  • ajustabilidad 
  • sencillez 
Whitepaper cultivo de células

Mis datos

TRABAJO LIMPIO EN EL LABORATORIO 

Un buen crecimiento celular es el objetivo de cualquier laboratorio de cultivo de células. Esto implica también la consiguiente eliminación y control de los riesgos de contaminación ocasionados por bacterias, levaduras, hongos, micoplasmas y contaminación cruzada. Entre las fuentes de contaminación se encuentran los cultivos de células, equipos, superficies, medios, reactivos y gérmenes contaminados. No obstante, la mayor fuente de contaminación es el humano. 

Es positivo que el personal de laboratorio contribuya a evitar la contaminación. Algunas de las condiciones son los protocolos, Standard Operation Procedures (SOP), las listas de comprobación y un proceso activo continuo de mejora. Hay que tener en cuenta siete aspectos: la higiene laboral personal, los equipos de laboratorio, los medios auxiliares, los puestos de trabajo, los reactivos y los medios así como el manejo. A continuación se muestran algunos consejos: 

1. HIGIENE LABORAL PERSONAL 

Lávese las manos antes y después del trabajo con cultivos de células para reducir el riesgo de contaminación o de contaminación cruzada. Utilice ropa de protección como guantes, redecilla para el pelo, bata, mascarilla y cubrecalzado. Los relojes de muñeca, anillos y teléfonos móviles son posibles fuentes de contaminación.  

Antes de la apertura de la puerta de cristal de una incubadora de CO2 debe comprobar dónde se encuentra el recipiente de cultivo que se va a extraer. Abra la puerta de cristal de forma cuidadosa y extraiga o introduzca los recipientes de cultivo rápidamente para cerrar a continuación la puerta de cristal y la puerta exterior.

2. EQUIPOS DE LABORATORIO, MEDIOS AUXILIARES Y PUESTOS DE TRABAJO 

La superficie de trabajo de un banco de pruebas de seguridad debe limpiarse al menos una vez al día y el interior, al menos una vez por semana. La sustitución de filtros HEPA, ULPA y para la radiación UV deberá efectuarse de forma oportuna. 

Las incubadoras de CO2 pueden esterilizarse por distintos procedimientos. Una esterilización por aire caliente a 180°C es fiable, reproducible y eficiente. El recipiente de agua debe limpiarse de forma regular y la incubadora, en función de los SOP. Las puertas interiores con divisiones contrarrestan la penetración de contaminación. 

Los puestos de trabajo deben limpiarse regularmente con un 70 % de etanol. Los derrames deben repararse de inmediato. 

3. REACTIVOS, MEDIOS Y MANEJO 

Los reactivos y medios estériles se contaminan por un manejo y almacenamiento inadecuados. Un manejo y utilización cuidadosos de los métodos de esterilización correspondientes, como las autoclaves y los filtros estériles, reducen el peligro de contaminación. 

frascos de células en la incubadora

4. INCUBADORAS DE CO2 

El principio "Less is more" en las incubadoras de CO2 comprende gran variedad de características constructivas, que garantizan un buen crecimiento y combaten el peligro de contaminación, p. ej., esquinas redondeadas en un espacio de incubación sin soldaduras, eliminación de estructuras innecesarias como, p. ej., para la conducción del aire en la incubadora, eliminación de ventiladores y filtro HEPA en el interior.  Encontrará más información importante en nuestraGuía del comprador para incubadoras de CO2

CONCLUSIONES

Organs-in-a-dish, alimentos cultivados in vitro y tratamientos terapéuticos novedosos, quién sabe qué más conseguirán los cultivos de células. Al igual que el propio cultivo de células sigue desarrollándose, nosotros también seguimos desarrollando nuestras incubadoras de CO2.  

Para ello,nuestra CB 170 ofrece unas nuevas soluciones excelentes, p. ej., un nuevo sensor IR, unas dimensiones reducidas en un interior aumentado, DuoDoor™ (una nueva solución inteligente para el manejo de la puerta) y la nueva e innovadora opción de acceso rápido a las muestras.  

Hemos mantenido la acreditada esterilización por aire caliente a 180 °C para la esterilización completa del interior, ahora una regla de oro, el interior de acero inoxidable sin soldaduras
y la gestión de la humedad patentada.

¿Desea conocer nuestras incubadoras de CO2? ¡Estamos encantados de asesorarle!

Mis datos