Le grand art de la culture cellulaire

Cette page scientifique présente une sélection de types de cultures cellulaires, paramètres et appareils pour les cultures de cellules eucaryotes de vertébrés et d’invertébrés. Des cultures de cellules végétales, par ex. Arabidopsis, seront brièvement mentionnées.

Les cultures d’organismes procaryotes, habituellement cultivées dans desétuves microbiologiques, ne font pas partie de cet article. 

Recherche pharmaceutique, recherche médicale, médecine reproductive (FIV), médecine régénérative (transplantations, prothèses, ingénierie des tissus), etc. Dans le monde entier, les laboratoires de culture cellulaire utilisent différentes cultures pour réaliser les tâches les plus variées. 

VUE D’ENSEMBLE DES CULTURES CELLULAIRES

Nous estimons ici qu’il est utile de clarifier les termes « sous verre ou en éprouvette » (in vitro) et « en dehors du vivant » (ex vivo).

Nous utilisons le terme « in vitro » pour les cultures de tissus et de cellules en dehors de l’organisme, dans des conditions physiologiques artificielles. Typiquement dans des récipients, plaques et boîtes de culture, avec milieux nutritifs comme RPMI-1640, DMEM ou Ham’s F-12, et par une température et une humidité simulées dans des étuves à CO2 ou des étuves bactériologiques à CO2/ O2. De telles cultures peuvent exister sans limite temporelle, comme c’est le cas pour la lignée cellulaire immortelle HeLa.

Ex vivo désigne des processus consistant à prélever des matières vivantes, comme du sang, pour un traitement, et à les réintroduire immédiatement dans le corps après culture dans une étuve à CO2. Par exemple, la thérapie génétique ex-vivo consiste à introduire des gènes dans les cellules. 

1. CULTURES PRIMAIRES, LIGNÉES CELLULAIRES ET SOUCHES CELLULAIRES 

Les cultures primaires sont issues de cellules, tissus ou organes directement prélevés sur un organisme. 

Après la première sous-culture (culture secondaire) ou le premier passage, une lignée cellulaire apparaît, dont la durée de vie limitée correspond notamment au vieillissement naturel des organismes vivants. 

Les cultures primaires de tissus normaux ont besoin d’un substrat solide pour s’y fixer (cultures adhérentes), tandis que les cellules tumorales peuvent être cultivées en suspension. 

Les cellules dérivées d’une culture primaire ou d’une lignée cellulaire par sélection ou clonage et possédant des propriétés spécifiques sont appelées souches cellulaires. 

2. CELLULES IMMORTELLES

Les cellules immortelles se distinguent par leur capacité à se diviser à l’infini. Cette « immortalité » est causée soit par infection virale, par ex. par le Papillomavirus HPV18 (cellules HeLa), par transfection avec des gènes ou des protéines immortels, ou encore par la technique des hybridomes. Ici, des cellules B produisant des anticorps sont fusionnées avec des cellules de myélome (cellules tumorales) afin de produire des anticorps monoclonaux. 

La lignée HeLa est l’une des lignées cellulaires permanentes les plus célèbres. Elle provient d’un prélèvement effectué sur l’Américaine Henrietta Lacks, atteinte d’un cancer du col de l’utérus, dans les années 1950 : c’était la première fois qu’une lignée cellulaire immortelle était obtenue à partir d’une cellule humaine. Depuis, plus de 50 tonnes de cellules HeLa ont été cultivées dans les laboratoires du monde entier. La science doit des dizaines de milliers d’expériences et de résultats aux robustes cellules HeLa.

Mais la lignée HeLa n’est pas la seule lignée cellulaire permanente à s’être établie dans la recherche. Aujourd’hui, on compte plus de 4 000 lignées cellulaires humaines et animales disponibles, notamment les cellules Vero (cellules du singe vert d’Afrique), les cellules HEK-293 (lignée de cellules rénales embryonnaires humaines) et les cellules K562 (la plus ancienne lignée cellulaire leucémique humaine). 

3. CELLULES ADHÉRENTES ET CULTURES EN SUSPENSION 

Les cellules adhérentes, comme celles des cultures HEK 293 et CHO (Chinese Hamster Ovary), se développent et se reproduisent uniquement si elles peuvent adhérer à la surface de récipients de culture. 

Ces cultures de cellules en deux dimensions se propagent sur leur support comme une couche monocellulaire (monocouche), jusqu’à obtenir une inhibition de contact cellulaire (confluence), et finalement jusqu’à ce que la culture meure. C’est pourquoi on utilise des flacons roulants dans les étuves à CO2, afin d’augmenter la surface de croissance. On utilise également des agitateurs afin d’améliorer les conditions de croissance des cultures cellulaires. Ces deux possibilités servent à effectuer un scale-up. Pour maintenir les cultures en phase de latence, des passages réguliers (transfert dans de nouveaux récipients de culture avec un milieu nutritif frais) sont nécessaires.

Les cultures en suspension, ou cultures non-adhérentes, sont composées de cellules animales, humaines ou végétales, qui se reproduisent dans un milieu nutritif liquide sans adhérer au récipient de culture. Seuls peu de types de cellules sont adaptés à une culture en suspension. On peut citer les cellules NS0 (myélome de la souris), utilisées aussi bien dans la recherche biomédicale que dans la production de protéines thérapeutiques. Dans les étuves à CO2, le scale-up des cultures en suspension a lieu par exemple dans des flacons d’agitation ou desagitateurs rotatifs.

4. CULTURES CELLULAIRES VÉGÉTALES 

Les cellules végétales peuvent également être cultivées in vitro. Les cultures sont obtenues à partir d’explants de feuilles, tiges, bulbes, ovaires de fruits, anthères ou racines. Pour les cultures à photosynthèse active, il faut garantir une intensité d’éclairage adéquate et un spectre lumineux adapté, par exemple dans les chambres de croissance pour plantes avec des lampes de croissance de type Fluora® ou de type lampe Arabidopsis. On utilise aussi des flacons roulants dans les chambres de croissance pour plantes, par ex. pour le scale-up, ainsi que des agitateurs rotatifs. 

Quelques sources 

LA DEMANDE AUGMENTE 

Différentes études de marché indiquent une forte croissance du marché des cultures cellulaires d’ici 2023, entre 30 et 35 milliards de dollars.  Ces analyses tiennent compte des domaines d’application, comme l’industrie pharmaceutique, la biotechnologie, la recherche sur le cancer et l’ingénierie des tissus, des appareils de laboratoire comme les autoclaves, les bioréacteurs, les centrifugeuses et les systèmes de filtration, ainsi que les consommables tels que les milieux sans sérum et les antibiotiques.  À lui seul, le marché des cultures cellulaires en 3D devrait gagner 2 milliards de dollars d’ici 2019. 

Par rapport aux cultures en 2D décrites plus haut, les cultures cellulaires en 3D sont plus similaires aux caractéristiques morphologiques, métaboliques et fonctionnelles in vivo.  Les systèmes de cultures en 3D peuvent être répartis en systèmes avec et sans matrice. Ils présentent un potentiel unique en tant que systèmes d’essais et de recherche pour les examens médicaux et pharmaceutiques.  Il existe ainsi des modèles 3D de tumeurs, de peau, d’intestins et de foies. 

Les systèmes de culture cellulaire en 3D sont utilisés dans le développement des médicament,
la recherche biologique et médicale, dans les domaines de la médecine régénérative et de l’ingénierie des tissus, l’analyse environnementale et pour remplacer les essais sur animaux.

Les produits biopharmaceutiques possèdent également un potentiel économique considérable. 

IOn compte de plus en plus de substances actives biopharmaceutiques produites à l’aide de cellules de mammifères, par exemple l’Herceptin, médicament contre le cancer du sein obtenu à partir de lignées cellulaires CHO.  Pour cela, on utilise de grands bioréacteurs ou réservoirs de fermentation.  Généralement, un fermenteur dont le volume dépasse 10 000 litres ne produira que quelques kilogrammes de substance active. 

L’un des meilleurs exemples du succès de la culture cellulaire à grande échelle est la production d’époétine α et β (érythropoïétine EPO) par un sous-clone génétiquement modifié d’une lignée cellulaire CHO.  EPO est une hormone protétique humaine, importante pour la formation des globules rouges, principalement prescrite aux patients atteints de cancers et de pathologies rénales. Avec un chiffre d’affaires annuel d’environ dix milliards d’euros, il s’agit du produit biopharmaceutique le plus vendu dans le monde entier.  

Les anticorps monoclonaux tous issus d’une même cellule B d’origine, et donc identiques et très spécifiques, peuvent aussi être cultivés en grandes quantités dans une étuve à CO2. En médecine, ils sont utilisés aussi bien pour le diagnostic que pour le traitement.

LABORATOIRE DE CULTURE CELLULAIRE, LES APPAREILS ET OUTILS 

ès la planification du laboratoire, puis lors de l’aménagement et de l’équipement avec des appareils de laboratoires, des récipients de cultures, des milieux nutritifs et jusqu’aux pipettes, il convient de respecter les mesures de protection des produits, des personnes et de l’environnement, ainsi que les consignes des BPL/GMP.

Le grand art de la culture cellulaire

PLANIFICATION ET ÉQUIPEMENT DU LABORATOIRE 

Les postes de sécurité biologiques et les étuves à CO2 doivent se trouver à proximité immédiate les uns des autres. Les portes de l’étuve à CO2 doivent s’ouvrir jusqu’au poste de travail, ce qui est particulièrement utile pour les passages, car le retrait et le chargement des récipients de culture peuvent avoir lieu rapidement et par le chemin le plus court. 

Il est également important de bien choisir l’emplacement d’installation dans le laboratoire. Il faut notamment éviter d’exposer les appareils de laboratoire au rayonnement direct du soleil ou d’installer les équipements dans des lieux à forte circulation d’air, par ex. à proximité de portes ou sous des dispositifs de climatisation dans le plafond. En outre, les consignes du fabricant concernant l’ensemble des dégagements doivent impérativement être respectées. Il va de soi que tous les appareils de laboratoire doivent être alignés à l’aide d’un niveau à bulle. 

Les autres appareils se trouvant dans un laboratoire de culture cellulaire sont par ex. des centrifugeuses, des réfrigérateurs, des congélateurs, des compteurs de cellules, des cryostats, des microscopes, des pipettes et des supports de pipettes. 

Le grand art de la culture cellulaire

OUTILS 

Récipients de culture 

Les boîtes de Pétri, flacons en T, plaques de microtitrage, par ex. conformes aux normes SLAS (Society For Laboratory Automation And Screening, autrefois norme SBS) pour les dépistages (HTS dans la recherche sur les principes actifs), films pour cultures cellulaires en 3D et flacons roulants ne sont que quelques exemples des récipients existants pour la culture de cellules adhérentes et en suspension ou les cultures cellulaires en gouttes suspendues. 

Milieux nutritifs 

Les milieux nutritifs sont particulièrement importants dans les cultures cellulaires, car ils fournissent les nutriments, facteurs de croissance et hormones nécessaires, mais aussi car ils jouent un rôle crucial dans la régulation du pH et de la pression osmotique. Il existe trois types de milieux : le milieu de base d’Eagle (Basal Medium Eagle, BME), le milieu pauvre en sérum et le milieu sans sérum, par ex. pour les hybridomes, les CHO, les kératinocytes et les cellules d’insectes. 

On peut également citer le RPMI-1640, le milieu Eagle modifié de Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) ou le Ham’s F12. Pour le nettoyage et le stockage à court terme (quelques minutes), on utilise des solutions salines équilibrées, comme les sels de Hanks ou les sels de Earle. 

PARAMÈTRES VITAUX 

VALEUR DE PH ET CONCENTRATION EN CO2 

La plupart des cellules de mammifères se sentent parfaitement bien à un pH de 7,4. Les lignées cellulaires transformées préfèrent un pH légèrement acide, compris entre 7,0 et 7,4, tandis que les lignées normales de fibroblastes privilégient des valeurs de pH plutôt basiques, entre 7,4 et 7,7. La valeur de pH optimale pour les lignées cellulaires d’insectes, comme Sf9 et Sf21, est égale à 6,2. 

La valeur pH présente un équilibre sensible entre le CO2 et le bicarbonate HCO3- dissous dans le milieu et la concentration en CO2 dans l’atmosphère. Pour cela, les milieux sont tamponnés, par ex. avec l’HEPES ou une solution tampon à base de CO2-bicarbonate. Les variations de la concentration de CO2 dans l’atmosphère entraînent des modifications indésirables de la valeur de pH dans la culture cellulaire. C’est pourquoi, en fonction de la culture cellulaire, une concentration de dioxyde de carbone comprise entre 5 et 7 % en volume est maintenue dans les étuves bactériologiques à CO2

Dans leurs modes d’emploi, certains fabricants d’étuves à CO2 indiquent des informations utiles concernant la variation des valeurs de pH dans les milieux en fonction de la concentration de CO2 dans l’étuve bactériologique. 

Aperçu des médias culturels

Exemple : si l’on mesure un pH de 7,2 dans un milieu tamponné avec 2,20 g de NaHCO3 par litre, la concentration de CO2 autour du milieu est égale à 8 % en volume.

La concentration de CO2 dans les étuves bactériologiques est mesurée à l’aide d’un capteur IR (capteur infrarouge) ou d’un capteur de conductivité thermique. 

NORMOXIE, HYPOXIE ET HYPEROXIE 

La concentration d’oxygène dans l’air est égale à 21 % en volume (normoxie). Les tissus adipeux, quant à eux, présentent une concentration en oxygène d’environ 10 à 15 %, pour la moelle osseuse celle-ci se situe à environ 6 à 7 %. En revanche, les tissus sensibles comme les poumons ou la rétine nécessitent des conditions hyperoxiques (21-90 % en vol.). 

Pour obtenir des concentrations en oxygène inférieures et supérieures à 21 % en volume, il faut utiliser des étuves bactériologiques à CO2/O2. Vous trouverez plus d’informations à ce sujet dans notrearticle de blog sur la normoxie et l’hypoxie

TEMPÉRATURE ET HUMIDITÉ DE L’AIR 

ATous les processus cellulaires sont soumis aux conditions thermiques. La température optimale pour les cultures cellulaires de mammifères est égale à 37 °C, tandis que les cellules d’insectes, de poissons et d’amphibiens requièrent la plupart du temps 25 à 28 °C.

Des valeurs d’humidité élevées dans les étuves à CO2 réduisent à un minimum les taux d’évaporation dans les milieux nutritifs, permettant ainsi de conserver la concentration osmotique souhaitées (osmolarité). 

Il existe différentes possibilités pour tempérer et humidifier les étuves à CO2

Une étuve bactériologique à CO2 de qualité garantit les conditions de croissance idéales à tous les types de cellules :

Vous trouverez plus d’informations sur la culture cellulaire ici !

LIVRE BLANC CULTURE CELLULAIRE EN ÉTUVE À CO2 

Des facteurs internes comme la température, la teneur en CO2 et en oxygène ou l’humidité, jusqu’à la validation de l’étuve bactériologique, en passant par les matériaux de l’étuve et leur nettoyage : un concept d’étuve bien pensé rassemble, contrôle et régule de nombreux paramètres différents. Pour la culture de tissus en étuve à CO2, chaque critère est important. Certaines valeurs de consigne sont même vitales pour les cultures cellulaires.  

C’est pour cette raison que la qualité des étuves bactériologiques pour cellules a été améliorée en continu, afin d’atteindre des objectifs concrets :

  • Conformité aux valeurs de consigne 
  • Précision maximale
  • Constance 
  • Contrôlabilité
  • Régulabilité
  • Simplicité
Whitepaper culture cellulaire

Mes données

TRAVAILLER PROPREMENT EN LABORATOIRE 

Tous les laboratoires de culture cellulaire souhaitent assurer une bonne croissance des cellules. Cela implique également l’élimination systématique et la maîtrise des risques de contamination causés par des bactéries, des levures, des champignons, des mycoplasmes ou des contaminations croisées. Les sources de contamination peuvent être des cultures cellulaires, appareils, surfaces, milieux ou réactifs contaminés, ainsi que des germes présents dans l’air. Mais la source de contamination la plus importante reste l’être humain.

Heureusement que les employés de laboratoires peuvent largement contribuer à la prévention de la contamination. Ils doivent pour cela rédiger des rapports, respecter des procédures standardisées (Standard Operation Procedures, SOP), établir des listes de contrôle et suivre un processus d’amélioration continu. Sept aspects doivent être ici pris en compte : hygiène personnelle au travail, appareils de laboratoire, outils et postes de travail, réactifs et milieux, et manipulation. Voici quelques conseils :


1. HYGIÈNE PERSONNELLE AU TRAVAIL

Lavez-vous les mains avant et après tout travail avec des cultures cellulaires afin de réduire le risque de contaminations ou de contaminations croisées. Portez des vêtements de protection comme des gants, un filet à cheveux, une blouse de laboratoire, une protection buccale et des surchaussures. Les montres-bracelets, les bagues et les téléphones portables sont des sources de contamination potentielles.  

Avant d’ouvrir la porte en verre d’une étuve à CO2, vérifiez où se trouve le récipient de culture à récupérer. Ouvrez ensuite la porte en verre avec précaution, récupérez ou déposez rapidement le récipient de culture puis fermez ensuite la porte en verre et la porte extérieure.

2. APPAREILS DE LABORATOIRE, OUTILS ET POSTES DE TRAVAIL 

La surface de travail d’un poste de sécurité doit être nettoyée au moins une fois par jour, et tout l’intérieur du poste de travail au moins une fois par semaine. Les émetteurs UV et les filtres HEPA ou ULPA doivent être remplacés dans les délais. 

Les étuves à CO2 peuvent être stérilisées selon différents procédés. Une stérilisation à l’air chaud à 180 °C est une méthode fiable, reproductible et efficace. Le bac à eau doit être nettoyé régulièrement, et l’étuve bactériologique conformément aux SOP. Les portes intérieures divisées permettent de repousser les sources contaminations.

Les postes de travail doivent être nettoyés régulièrement avec des produits à 70 % d’éthanol. Les matières renversées doivent immédiatement être éliminées.

3. RÉACTIFS, MILIEUX ET MANIPULATION

Les réactifs et milieux stériles peuvent être contaminés suite à une mauvaise manipulation ou un mauvais stockage. Un maniement prudent et l’utilisation de méthodes de stérilisation adaptées, par ex. autoclaves et filtres stériles, permettent de réduire le risque de contamination.

 Flacons cellulaires en étuve bactériologique

4. ÉTUVES À CO2

Le principe « less is more » pour les étuves à CO2 reprend de nombreuses caractéristiques constructives qui garantissent une bonne croissance et évitent les risques de contamination.
On peut notamment citer les coins arrondis dans un espace d’incubation sans soudures,
la suppression des éléments encastrés inutiles, comme ceux utilisés pour guider l’air dans l’étuve, la suppression des ventilateurs et des filtres HEPA dans l’espace intérieur.  Vous trouverez encore plus de détails dans notre Guide de l’acheteur pour les étuves à CO2.

BILAN

Organs-in-a-dish, aliments cultivés in vitro et approches thérapeutiques innovantes : qui sait ce que nous réserve la culture cellulaire à l’avenir. À l’image de la culture cellulaire, nos étuves à CO2 ne cessent elles aussi d’évoluer.  

Ainsi, notre CB 170 présente certaines solutions géniales et novatrices, comme un nouveau capteur IR, des dimensions extérieures réduites pour un intérieur agrandi, et DuoDoor™, un nouveau système intelligent pour la commande des portes, ainsi qu’une nouvelle option innovante d’accès rapide aux échantillons.  

Nous avons conservé notre système éprouvé de stérilisation à l’air chaud à 180 °C pour stériliser intégralement l’ensemble de l’intérieur, ce qui est désormais une règle d’or, ainsi que l’intérieur en acier inoxydable sans soudures et la gestion brevetée de l’humidité. 

Vous souhaitez découvrir nos étuves à CO2 ? Nous serons heureux de vous conseiller ! 

Mes données