La raffinata arte della coltivazione cellulare

In questa pagina informativa viene presentata una selezione di tipi di colture cellulari, parametri
e apparecchi per colture cellulari eucariotiche di vertebrati e invertebrati. Si fa anche brevemente riferimento alle colture cellulari vegetali, ad es. di arabidopsis.

Le colture da esseri viventi procariotici, che vengono tipicamente coltivate in incubatori microbiologici, non rientrano tra i temi trattati nel presente contributo. 

Ricerca farmaceutica, ricerca medica, medicina riproduttiva (FIVET), medicina rigenerativa (trapianti, protesi, ingegneria tissutale) e molto altro ancora. Nei laboratori di coltura cellulare di tutto il mondo vengono impiegate differenti colture cellulari per le finalità più varie. 

PANORAMICA DELLE COLTURE CELLULARI 

A questo punto ci pare opportuno un chiarimento terminologico relativo alle espressioni “in vetro o in provetta” (in vitro) e “proveniente dal vivente” (ex vivo). 

Noi utilizziamo il termine “in vitro” per colture cellulari e di tessuti al di fuori dell’organismo in presenza di condizioni fisiologiche artificiali. Normalmente in recipienti, piastre e capsule per colture cellulari, con terreni di coltura, ad es. RPMI-1640, DMEM oppure Ham’s F-12, e in presenza di temperatura e umidità simulate entro incubatori a CO2 ovvero incubatori a CO2/ O2. Tali colture, come nel caso della linea cellulare immortalizzata HeLa, possono continuare
a sussistere senza limiti temporali.

Ex vivo designa procedure in cui del materiale vivente, ad es. sangue, viene prelevato per essere trattato, e dopo la coltivazione in un incubatore a CO2 re-immesso in tempi brevi nel corpo. È così che, ad esempio, nell’ambito della terapia genetica ex vivo, dei geni vengono inseriti in cellule. 

1. COLTURE PRIMARIE, LINEE CELLULARI E CEPPI CELLULARI 

Le colture primarie derivano da cellule, tessuti e organi che sono stati prelevati direttamente da un organismo.

Dopo la prima sub-coltura (coltura secondaria) ovvero il primo passaggio nasce una linea cellulare, la cui limitata durata di vita corrisponde non da ultimo al processo naturale di senescenza degli organismi viventi. 

Le colture primarie da tessuti normali necessitano di un substrato solido a cui aderire (colture aderenti), mentre le cellule tumorali possono essere coltivate in sospensione.

Le cellule con caratteristiche specifiche derivate da una coltura primaria o da una linea cellulare tramite selezione o clonazione vengono chiamate ceppo cellulare.

2. CELLULE IMMORTALIZZATE

Le cellule immortalizzate sono caratterizzate dalla possibilità di una loro divisione illimitata. Una tale “immortalità” si ottiene mediante infezione con virus, ad es. con il Papilloma Virus HPV18 (cellule HeLa), mediante trasfezione con geni immortalizzati o proteine, nonché mediante la tecnica dell’ibridoma. In tal caso cellule B produttrici di anticorpi vengono fuse con cellule di mieloma (cellule tumorali) al fine di produrre anticorpi monoclonali. 

Una delle linee cellulari permanenti più famosa è la linea HeLa. Essa è stata estratta negli anni 50 dal carcinoma della cervice uterina dell’americana Henrietta Lacks: la prima volta che da una cellula umana si è riusciti ad ottenere una linea cellulare immortalizzata. Da allora, nei laboratori di tutto il mondo sono state coltivate più di 50 tonnellate di cellule HeLa. La scienza deve alle resistenti cellule HeLa migliaia di esperimenti e risultati. 

La linea cellulare HeLa non è però la sola ad essersi imposta nel campo della ricerca. Oramai l’elenco delle linee cellulari disponibili, umane e animali, comprende più di 4.000 voci. Tra di esse le cellule Vero (linea cellulare African Green Monkey), le cellule HEK-293 (linea cellulare Human Embryonic Kidney), e le cellule K562 (la più antica linea cellulare della leucemia umana). 

3. CELLULE ADERENTI E COLTURE IN SOSPENSIONE 

Le cellule aderenti, come ad es. le colture cellulari HEK 293 e CHO (Chinese Hamster Ovary) crescono e si moltiplicano solo se possono aderire alla superficie di recipienti di coltura. 

In quanto colture bidimensionali esse proliferano sul loro supporto come uno strato unico di cellule (monolayer) fino al raggiungimento dell’inibizione da contatto (confluenza) per pervenire, infine, al decadimento della coltura. Pertanto negli incubatori a CO2 per ampliare la superficie di crescita vengono impiegati flaconi a rulli. Allo stesso modo si ricorre ad agitatori per migliorare le condizioni di crescita delle colture cellulari aderenti. Ambedue le possibilità servono allo scale-up. Per mantenere delle colture nella fase di crescita esponenziale o log è necessario eseguire a intervalli regolari un passaggio (trasferimento in nuovi recipienti di coltura con terreno di coltura fresco). 

Le colture in sospensione o colture non aderenti sono cellule animali, umane o vegetali che si moltiplicano in un terreno di coltura fluido senza aderire al recipiente di coltura. Solo pochi tipi di cellule sono adatte a una coltura in sospensione, ad es. le cellule NS0 (mouse myeloma), che vengono utilizzate sia nella ricerca biomedica che nella produzione di proteine terapeutiche. Negli incubatori a CO2 avviene lo scale-up delle colture in sospensione ad es. in flaconi spinner o agitatori a rotazione

4 COLTURE CELLULARI VEGETALI 

Anche le cellule vegetali possono essere coltivate in vitro. Le colture derivano da espianti da foglie, fusti del germoglio, tuberi, ovari, antere o radici. Nel caso di colture fotosinteticamente attive deve essere assicurata la presenza di un’adeguata intensità dell’illuminazione e di un idoneo spettro di luce, ad es, in camere di crescita vegetale con luci di crescita del tipo Fluora®
o del tipo lampada per arabidopsis. Anche nelle camere di crescita vegetale vengono impiegati flaconi a rulli, ad es. per lo scale-up, nonché agitatori a rotazione.

Alcune fonti di approvvigionamento 

IL FABBISOGNO CRESCE 

Diverse analisi di mercato evidenziano per il mercato mondiale delle colture cellulari una forte crescita, compresa tra i 30 e i 35 miliardi di dollari, fino al 2023.  Tali previsioni tengono conto di campi di applicazione quali ad es. l’industria farmaceutica, le biotecnologie, la ricerca sul cancro e l’ingegneria tissutale, degli apparecchi di laboratorio come autoclavi, bioreattori, centrifughe e sistemi di filtrazione, nonché dei materiali di consumo come terreni di coltura senza siero e antibiotici.  Il solo mercato delle colture cellulari tridimensionali dovrebbe crescere entro il 2019 fino a oltre 2 miliardi di dollari. 

Rispetto alle colture bidimensionali fin qui descritte, quelle tridimensionali presentano una maggiore somiglianza con le caratteristiche morfologiche, metaboliche e funzionali in vivo. 
I sistemi di colture tridimensionali possono essere suddivisi in sistemi con e senza matrice di supporto. Esse hanno un potenziale unico come sistemi di test e di ricerca per le analisi mediche e farmaceutiche.  Esistono così modelli tridimensionali di tumore, di pelle, di intestino e di fegato.

I sistemi di colture cellulari tridimensionali vengono impiegati nello sviluppo di medicinali, nella ricerca biologica e medica, nei settori della medicina rigenerativa e dell’ingegneria tissutale, dell’analisi ambientale e in sostituzione degli esperimenti sugli animali. 

I biofarmaci posseggono a loro volta un potenziale economico enormemente elevato. 

I principi attivi biofarmaceutici, prodotti con l’ausilio di cellule di mammiferi, come ad es. il farmaco per la cura del tumore del seno Herceptin ricavato da linee cellulari CHO, divengono sempre più numerosi.  A tale scopo vengono utilizzati grandi bioreattori ovvero serbatoi di fermentazione.  Dentro fermentatori con una capacità superiore a 10.000 litri di regola vengono ricavati solo pochi chilogrammi di principio attivo. 

Uno degli esempi di maggior successo nel campo della produzione su larga scala di coltivazioni cellulari è rappresentato dall’epoetina α e β (eritropoietina-EPO) mediante un subclone geneticamente modificato di una linea cellulare CHO.  L’EPO è un ormone umano glicoproteico importante per la produzione di globuli rossi, prescritto dai medici soprattutto a pazienti affetti da cancro e insufficienza renale. Con un fatturato annuo di circa dieci miliardi di euro rappresenta il biofarmaco guida a livello mondiale.  

Anche gli anticorpi monoclonali, che derivano tutti da una sola cellula B originaria e, pertanto sono identici e molto specifici, possono essere prodotti in gran quantità nell’incubatore a CO2. Nella medicina essi vengono impiegati sia in campo diagnostico che in quello terapeutico. 

LABORATORIO DI COLTURA CELLULARE, APPARECCHI DI LABORATORIO E STRUMENTI AUSILIARI 

Cominciando dalla progettazione del laboratorio, dal suo allestimento, per passare alla dotazione di apparecchiature, recipienti di coltura, terreni di coltura e per finire con le pipette, vale sempre il principio del rispetto delle misure di protezione del prodotto, delle persone e dell’ambiente come pure delle prescrizioni della GLP ovvero della GMP. 

La raffinata arte della coltivazione cellulare

PROGETTAZIONE DEL LABORATORIO E SUA DOTAZIONE DI APPARECCHIATURE 

I banchi di lavoro di sicurezza biologici e gli incubatori a CO2 dovrebbero trovarsi molto vicini gli uni agli altri. Gli sportelli dell’incubatore a CO2 dovrebbero aprirsi in direzione della postazione di lavoro. Ciò è particolarmente utile in sede di effettuazione di passaggi, poiché il prelievo e il carico dei recipienti di coltura deve avvenire rapidamente e per la via più breve. 

È importante anche la scelta del luogo di installazione giusto nel laboratorio. Si dovrebbe evitare l’irraggiamento solare diretto degli apparecchi di laboratorio come pure luoghi di installazione con elevata movimentazione dell’aria, ad es. in prossimità di porte o impianti di climatizzazione a soffitto. Inoltre vanno assolutamente rispettate le indicazioni del produttore quanto alle distanze dalle pareti su tutti i lati. È ovvio che tutti gli apparecchi di laboratorio devono essere allineati mediante livella. 

Ulteriori apparecchiature presenti in un laboratorio per colture cellulari sono ad es. centrifughe, frigoriferi, freezer, conta-cellule, criostati, microscopi, pipette e porta-pipette.

Coltivazione cellulare nell’incubatore

STRUMENTI AUSILIARI 

Recipienti di coltura 

Piastre di Petri, fiasche a T, piastre per microtitolazione, ad es. secondo gli standard SLAS (Society For Laboratory Automation And Screening, ex standard SBS) per screening (HTS nella ricerca sui principi attivi), pellicole per colture cellulari tridimensionali e flaconi a rulli costituiscono solo una piccola parte dei possibili recipienti di coltura cellulare per colture aderenti e in sospensione o per le colture cellulari con tecnica della goccia pendente. 

I terreni di coltura sono particolarmente importanti nel campo della coltivazione cellulare poiché essi forniscono le sostanze nutritive, i fattori di crescita e gli ormoni necessari, giocando però anche un ruolo decisivo nella regolazione del valore del pH e della pressione osmotica. Esistono tre tipi di terreno di coltura: terreno basale Eagle (BME), terreno con siero ridotto e terreno privo di siero, ad es. per ibridoma, CHO, cheratinociti e cellule di insetti. 

Ulteriori esempi sono: RPMI-1640, Dulbecco’s Modified Eagle Medium oppure Ham's F12.
Per il lavaggio e lo stoccaggio di breve durata (pochi minuti) vengono utilizzate soluzioni saline bilanciate come i sali Hanks o quelli Earle.

PARAMETRI DI IMPORTANZA VITALE 

VALORE DEL PH E CONCENTRAZIONE DI CO2

La maggioranza delle cellule di mammiferi predilige un pH di 7,4. Le linee cellulari trasformate preferiscono valori del pH leggermente acidi tra 7,0 e 7,4, mentre le normali linee cellulari di fibroplasti valori del pH leggermente basici tra 7,4 e 7,7. Le linee cellulari di insetti, come ad es. Sf9 ed Sf21, hanno un pH ottimale di 6,2. 

Nel caso del valore del pH sussiste un equilibrio sensibile tra la CO2 disciolta e il bicarbonato HCO3 nel terreno di coltura e la concentrazione di CO2 nell’atmosfera. A tale scopo i terreni di coltura sono dotati di agente tampone, ad es. di HEPES organico o di un tampone a base di bicarbonato con CO2. Le oscillazioni nella concentrazione di CO2 dell’atmosfera comportano modifiche indesiderate del valore del pH nella coltura cellulare. Pertanto, negli incubatori a CO2, a seconda del tipo di coltura cellulare, viene mantenuta una concentrazione di biossido di carbonio compresa tra 5 e 7 vol. %. 

Alcuni produttori di incubatori a CO2 offrono nelle loro istruzioni per l’uso utili informazioni sulla dipendenza dei valori del pH nei terreni di coltura dalla concentrazione di CO2 nell’incubatore. 

Panoramica dei media culturali

Esempio: se viene misurato un pH di 7,2 in un terreno di coltura che contiene come agente tampone 2,20 g di NaHCO3 per litro, la concentrazione di CO2 nell’ambiente circostante al terreno di coltura ammonta a 8 vol.-%. 

La concentrazione di CO2 negli incubatori viene misurata o con un sensore IR (sensore agli infrarossi) o con un sensore WLD (sensore a conducibilità termica).

NORMOSSIA, IPOSSIA E IPEROSSIA  

La concentrazione di ossigeno dell’aria ammonta a 21 vol.% (normossia). Il tessuto adiposo, però, presenta una concentrazione di ossigeno del dieci-quindici per cento circa, mentre il midollo osseo ha una concentrazione di ossigeno del sei-sette per cento circa. Al contrario, tessuti sensibili come il polmone o la retina, necessitano di condizioni iperossiche (21-90 vol.%). 

Per ottenere concentrazioni di ossigeno superiori o inferiori a 21 vol.% sono necessari gli incubatori a CO2/O2. Maggiori informazioni al riguardo sono contenute nel nostro contributo per il blog su normossia e ipossia

TEMPERATURA E UMIDITÀ DELL’ARIA 

Tutti i processi cellulari dipendono dalla temperatura. Le colture cellulari di mammiferi hanno una temperatura ottimale di 37°C, mentre le colture cellulari di insetti, pesci o anfibi necessitano per lo più temperature comprese tra 25 e 28°C. 

Elevati valori di umidità negli incubatori a CO2 riducono al minimo il tasso di evaporazione nei terreni di coltura, mantenendo così la concentrazione osmotica desiderata (osmolarità). 

Per temperare e umidificare gli incubatori a CO2 vi sono diverse possibilità.

Un incubatore a CO2 di elevata qualità garantisce condizioni di crescita ottimali per ogni tipo di cellule: 

Qui potete trovare maggiori informazioni sulla coltivazione cellulare!

WHITEPAPER SULLA COLTIVAZIONE CELLULARE NELL’INCUBATORE A CO2 

Dai fattori caratteristici del vano interno quali temperatura, contenuto di CO2, contenuto di ossigeno o umidità, attraverso i materiali dell’incubatore e la sua pulizia per arrivare alla validazione dell’incubatore: un incubatore concepito in modo ponderato comprende, controlla e regola molti parametri diversi. Nella coltivazione di tessuti nell’incubatore a CO2 ciascun criterio gioca un ruolo. Alcuni valori impostati sono addirittura di importanza vitale per le colture cellulari.  

Pertanto gli incubatori per cellule sono stati perfezionati ininterrottamente al fine di conseguire precisi obiettivi: 

  • Raggiungimento del valore impostato 
  • Massima precisione 
  • Costanza
  • Controllabilità 
  • Regolabilità
  • Semplicità 
coltivazione di cellule

I miei dati

PULIZIA SUL LAVORO IN LABORATORIO 

L’obiettivo di ogni laboratorio di coltura cellulare è ottenere una buona crescita delle cellule. Ciò significa anche eliminazione consequente e controllo dei rischi di contaminazioni che insorgono a causa di batteri, lieviti, funghi, micoplasmi e di contaminazioni incrociate. Le fonti di contaminazione possono essere colture cellulari contaminate, apparecchi, superfici, terreni di coltura, reagenti, nonché germi trasmessi per via aerea. La fonte più importate di contaminazione sono però le persone. 

Fortunatamente gli addetti al laboratorio possono contribuire notevolmente a prevenire le contaminazioni. Protocolli, procedure operative standard (SOP), liste di controllo, e un processo continuo e vitale di miglioramento ne costituiscono i presupposti. A questo riguardo, sono sette gli aspetti da tenere in considerazione: l’igiene personale sul lavoro, gli apparecchi di laboratorio, gli strumenti ausiliari e le postazioni di lavoro, i reagenti e i media, come pure le operazioni di manipolazione. Ecco solo alcuni consigli: 

1. IGIENE PERSONALE SUL LAVORO 

Lavarsi le mani prima e dopo avere svolto operazioni sulle colture cellulari, al fine di ridurre i rischi di contaminazioni ovvero di contaminazioni incrociate. Indossare abbigliamento di protezione come guanti, retina per capelli, camice da laboratorio, mascherina e copriscarpe. Orologi da polso, anelli e cellulari sono potenziali fonti di contaminazione. 

Prima dell’apertura di una porta in vetro di un incubatore a CO2 bisognerebbe accertarsi dove si trovi il recipiente di coltura da prelevare. Si dovrebbe aprire con cautela la porta di vetro, prelevare o inserire rapidamente i recipienti di coltura, per poi richiudere la porta in vetro e lo sportello esterno. 

2. APPARECCHI DI LABORATORIO, STRUMENTI AUSILIARI E POSTAZIONI DI LAVORO 

La superficie di lavoro di un banco di lavoro di sicurezza dovrebbe essere pulita almeno una volta al giorno, l’intero ambiente interno di lavoro almeno una volta alla settimana. La sostituzione di emettitori di UV e filtri HEPA ovvero ULPA dovrebbe avvenire per tempo. 

Gli incubatori a CO2 possono essere sterilizzati con differenti procedure. La sterilizzazione ad aria calda a 180°C è affidabile, riproducibile ed efficace. La vaschetta dell’acqua dovrebbe essere regolarmente pulita, l’incubatore conformemente alla procedura operativa standard (SOP). Le porte interne suddivise impediscono la penetrazione di contaminazioni. 

Le postazioni di lavoro andrebbero pulite regolarmente con il 70% di etanolo. Tutto ciò che viene inavvertitamente versato andrebbe rimosso immediatamente. 

3. REAGENTI, MEDIA E OPERAZIONI DI MANIPOLAZIONE 

I reagenti e i media sterili vengono contaminati a causa di manipolazione e stoccaggio scorretti. Un attento utilizzo di corrispondenti metodi di sterilizzazione, ad esempio autoclavi e filtri sterili, riduce il pericolo di contaminazione.

Flaconi per colture cellulari nell’incubatore

4. INCUBATORI A CO2

Il principio “less is more” applicato a incubatori a CO2 comprende un gran numero di caratteristiche costruttive in grado di garantire una buona crescita e di combattere il rischio di contaminazioni, ad es. angoli arrotondati in un vano di incubazione senza cordoni di saldatura, rinuncia a strutture interne superflue, come ad es. per la conduzione dell’aria dentro l’incubatore, rinuncia a ventilatori e filtri HEPA nel vano interno.  Altri elementi importanti sono riportati nella nostra Buyer’s Guide sugli incubatori a CO2

CONCLUSIONI 

Mini organi in piastra, generi alimentari coltivati in vitro e approcci terapeutici di nuova concezione: chissà che cosa dobbiamo ancora aspettarci dalle colture cellulari. Parallelamente allo sviluppo continuo delle colture cellulari, anche i nostri incubatori a CO2 conoscono un processo ininterrotto di perfezionamento.  

Al riguardo, il nostro CB 170 può vantare alcune nuove caratteristiche di rilievo, ad es. un nuovo sensore IR, dimensioni esterne ridotte a fronte di un vano interno maggiorato, DuoDoor™ - una nuova soluzione intelligente per l’apertura porta e sportello, e la nuova opzione innovativa dell’accesso rapido ai campioni.  

Abbiamo mantenuto la comprovata sterilizzazione ad aria calda a 180°C, per la completa sterilizzazione dell’intero vano interno, che ora costituisce lo standard di riferimento, il vano interno in acciaio inox senza cordoni di saldatura, nonché la gestione dell’umidità brevettata.

Desiderate conoscere i nostri incubatori a CO2? Siamo a vostra completa disposizione per una consulenza!

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