De hoge kunst van de celcultivering

Op deze kennispagina kijken we naar een aantal geselecteerde celcultuursoorten, parameters en apparaten voor eukaryotische celculturen van gewervelde en ongewervelde dieren. Hierbij wordt kort ingegaan op plantaardige celculturen zoals arabidopsis.

Culturen uit prokaryotische organismen die meestal in microbiologische incubatoren worden gecultiveerd wordt in deze blog niet behandeld.

Farmaceutisch onderzoek, medisch onderzoek, reproductieve geneeskunde (ivf), regeneratieve geneeskunde (transplantatie, prothesen, tissue engineering) etc. Wereldwijd worden in celcultuurlaboratoria verschillende celculturen ingezet om uiteenlopende taken uit te voeren.

OVERZICHT CELCULTUREN

Hier lijkt het zinvol om de termen ‘onder glas of in reageerbuis’ (in vitro) en ’buiten het lichaam’ (ex vivo) uit te leggen.

Wij gebruiken de term ‘in vitro’ voor cel- en weefselculturen buiten het organisme onder kunstmatige fysiologische condities. Deze zitten normaal in kweekbakjes, -plaatjes en -flesjes met voedingsbodems zoals RPMI-1640, DMEM of Ham’s F-12 en worden onder gesimuleerde temperatuur- en vochtigheidscondities gebruikt in CO2-incubatoren ofwel CO2/ O2-incubatoren. Dergelijke culturen kunnen net als de onsterfelijk gemaakte HeLa-cellijn voor onbeperkte tijd bestaan.

Met ex vivo worden procedures aangeduid waarbij levend materiaal zoals bloed voor de behandeling wordt afgenomen en na de cultuur in een CO2-incubator binnen korte tijd worden weer worden geretourneerd aan het lichaam. Zo worden bijvoorbeeld bij de ex-vivo-gentherapie genen in cellen ingebracht.

1. Primaire culturen, cellijnen en celstammen

Primaire culturen ontstaan uit cellen, weefsels of organen die direct uit een organisme worden gehaald.

Na de eerste subcultuur (secundaire cultuur) of het eerste overzetten van de cellen naar een nieuw een nieuw kweekbakje ontstaat een cellijn met een gelimiteerde levensduur die niet in de laatste plaats overeenkomt met het natuurlijke verouderingsproces van het levende organisme.

Voor primaire culturen uit normaal weefsel is een vast substraat nodig voor het aanhechten (adherente culturen), terwijl tumorcellen in suspensie kunnen worden gecultiveerd.

De van een primaire cultuur of cellijn door selecteren of klonen afgeleide cellen met specifieke eigenschappen noemt men een celstam.

2. Onsterfelijk gemaakt te stellen

Onsterfelijk gemaakte cellen kenmerken zich door de mogelijkheid van een onbeperkte celdeling. Deze ‘onsterfelijkheid’ ontstaat ofwel door infectie met virussen, bijvoorbeeld door het papillomavirus HPV18 (HeLa-cellen), door transfectie met onsterfelijk gemaakte genen of eiwitten en met behulp van de hybridoma-techniek. Hierbij worden B-cellen die antilichamen produceren gefuseerd met myeloomcellen (tumorcellen) om monoklonale antilichamen te produceren.

Één van de beroemdste permanente cellijnen is de HeLa-cellijn. Deze werd in de jaren 50 uit het cervixcarcinoom van de Amerikaanse Henrietta Lacks geëxtraheerd – de eerste keer dat uit een menselijke cel een onsterfelijk gemaakte cellijn werd gewonnen. Sindsdien werd meer dan 50 ton HeLa-cellen in laboratoria in de hele wereld gekweekt. De wetenschap heeft met de robuuste HeLa-cel tig duizenden experimenten kunnen uitvoeren en resultaten weten te behalen.

Daarbij is de HeLa-cellijn niet de enige permanente cellijn die zijn nut in het wetenschappelijke onderzoek heeft bewezen. Inmiddels staan er meer dan 4000 items op de lijst met beschikbare menselijke en dierlijke cellijnen. Bijvoorbeeld de Vero-cellen (African Green Monkey), de HEK-293-cellen (Human Embryonic Kidney) en de K562-cellen (oudste menselijke leukemiecellijn).

3. Adherente cellen en suspensieculturen

Adherente cellen zoals de celculturen HEK 293 en CHO (Chinese Hamster Ovary) vermenigvuldigen zich alleen als ze zich kunnen hechten aan het oppervlak van kweekbakjes.

Deze bereiden zich als tweedimensionale celcultuur uit als eencellige laag (monolayer) totdat er een contactinhibitie (confluentie) ontstaat en de cultuur uiteindelijk afsterft. In CO2-incubatoren worden daarom voor de vergroting van het groei-oppervlak zogenaamde roll-on-flesjes gebruikt. Schudders worden ingezet om de groeicondities van de adherente celculturen te verbeteren. Beide mogelijkheden worden ingezet voor een opschaling. Om culturen in de logfase te houden moeten deze regelmatig worden overgezet naar nieuwe kweekbakjes met verse voedingsstoffen.

Slechts enkele celsoorten zijn geschikt voor een suspensiecultuur, zoals NS0-cellen (mouse myeloma) die zowel in biomedisch onderzoek als bij de productie van therapeutische eiwitten worden ingezet. Suspensieculturen worden In CO2-incubatoren opgeschaald, bijvoorbeeld in roerflessen of trilschudders.

4. Plantaardige celculturen

Ook plantaardige cellen kunnen in vitro worden gecultiveerd. De culturen ontstaan uit explantaten van bladeren, stengels, knollen, vruchtbeginsels, helmknop of wortels. Bij fotosynthetisch actieve culturen moet een adequate verlichtingssterkte en een geschikt lichtspectrum aanwezig zijn, bijvoorbeeld in kweekkasten met kweeklampen van het type Fluora® of een arabidopsis-lamp. In kweekkasten worden ook roll-on-flesjes, bijvoorbeeld voor het opschalen, en trilschudders ingezet.

Enkele referentiebronnen

De vraag neemt toe

Meerdere marktanalyses voorspellen een sterke groei – tussen 30 en 35 miljard dollar – van de wereldwijde celcultuurmarkt tot 2023. Hierbij werd rekening gehouden met toepassingsgebieden als farmaceutische industrie, biotechnologie, kankeronderzoek en tissue engineering, laboratoriumapparatuur – bijv. autoclaven, bioreactoren, centrifuges en filtratiesystemen – en verbruiksmaterialen als serumvrij medium en antibiotica. Alleen al de markt voor 3D-celculturen zal naar verwachting tot 2019 groeien tot meer dan 2 miljard dollar.

Vergeleken met de beschreven 2D-culturen lijken de 3D-celculturen meer op de morfologische, metabolische en functionele eigenschappen in vivo. 3D-cultuursystemen kunnen worden onderverdeeld in matrix- en matrixvrije systemen. Deze beschikken over een uniek potentieel als test- en onderzoekssysteem voor geneeskundig en farmaceutisch onderzoek. Zo zijn er 3D-tumormodellen, 3D-huidmodellen, 3D-darmmodellen en 3D-levermodellen.

3D-celculturensystemen worden toegepast bij de ontwikkeling van geneesmiddelen, bij biologisch en geneeskundig onderzoek, in de regeneratieve geneeskunde en tissue engineering, in de milieu-analyse en als vervanging voor dierproeven.

Ook biologicals hebben een enorm groot economisch potentieel.

Het aantal biologisch werkzame stoffen dat met behulp van zoogdiercellen wordt geproduceerd neemt toe, bijvoorbeeld het geneesmiddel tegen borstkanker Herceptin uit CHO-cellijnen. Daarvoor worden grote bioreactoren of fermentatietanks ingezet. In fermentatietanks met een volume van meer dan 10.000 liter ontstaan in de regel slechts enkele kilo's werkzame stof.

Een van de meest succesvolle voorbeelden voor celcultivering op grote schaal is de productie van epoëtine α en β (erythropoëtine-EPO) door een genetisch gemodificeerde subkloon van een CHO-cellijn. EPO is een menselijk eiwithormoon dat belangrijk is voor de vorming van rode bloedcellen en door artsen vooral wordt voorgeschreven voor kanker- en nierpatiënten. Met een jaaromzet van zo'n tien miljard euro is dit het belangrijkste biologische geneesmiddel ter wereld.

Ook monoklonale antilichamen die allemaal uit een enkele oorspronkelijke B-cel stammen en daarom identiek en zeer specifiek zijn, kunnen in grote hoeveelheden in een CO2-incubator worden gekweekt. Deze worden in de geneeskunde zowel in de diagnostiek als in de therapie gebruikt.

Celcultuurlaboratorium – Apparaten en hulpmiddelen

Al bij de planning en inrichting van een laboratorium, de aanschaf van laboratoriumapparatuur, kweekbenodigdheden, voedingsbodems tot aan de pipetten moet rekening worden gehouden met de bescherming van personen, milieu en producten. Ook aan de eisen de GLP en GMP moet worden voldaan.

De hoge kunst van de celcultivering

Planning en inrichting van laboratorium

Biologische veiligheidswerkbanken en CO2-incubatoren moeten dicht bij elkaar staan. De deuren van de CO2-incubator moeten naar de werkplek openen. Dit is vooral praktisch bij het overzetten van de celculturen omdat het uitnemen en vullen van kweekschalen snel en zonder omwegen moet worden uitgevoerd.

Ook het kiezen van de juiste opstellocatie in het laboratorium is belangrijk. Zo moeten opstellocaties met zonne-instraling op laboratoriumapparaten en sterke luchtbewegingen, bijvoorbeeld in de buurt van deuren of plafondairco's, worden vermeden. Bovendien moeten de specificaties van de fabrikant over de afstanden tot muren altijd worden aangehouden.
Het is vanzelfsprekend dat alle laboratoriumapparaten worden uitgelijnd met een waterpas.

Andere apparaten in een celcultuurlaboratorium zijn bijvoorbeeld centrifuges, koelkasten, freezers, celtellers, cryostaten, microscopen, pipetten en pipethouders.

Celcultivering in een incubator

Hulpmiddelen

Kweekbenodigdheden

Petrischalen, T-Flasks, microtiterplaten, bijv. volgens SLAS Standards (Society For Laboratory Automation And Screening, vroeger SBS-Standard) voor screening (HTS in het onderzoek naar werkzame stoffen), folies voor 3D-celculturen en roll-on-flesjes zijn slechts een kleine keuze uit alle mogelijke kweekbakken voor de celcultivering van adherente en suspensieculturen
of hangende druppel-celculturen.

Voedingsbodems

Voedingsbodems zijn bijzonder belangrijk in de celcultuur omdat ze de benodigde voedingsstoffen, groeifactoren en hormonen leveren, maar ook een beslissende rol spelen bij het regelen van de pH-waarde en de osmotische druk. Er zijn drie soorten voedingsstoffen: Basal Medium Eagle (BME), voedingsstoffen met gereduceerd serum en serumvrije voedingsstoffen, bijv. voor hybridoma, CHO, keratinocyten en insectencellen.

Andere voorbeelden zijn: RPMI-1640, Dulbecco’s Modified Eagle Medium of Ham's F12. Voor het groeien en korte opslag (enkele minuten) worden Balanced Salt Solutions zoals Hanks zouten of Earle's zouten ingezet.

Vitale parameters

pH-waarde en CO2-concentratie

De meeste zoogdiercellen voelen zich goed bij een pH-waarde van 7,4. Getransformeerde cellijnen hebben een voorkeur voor licht zure pH-waarden tussen 7,0 en 7,4. Normale fibroblast-cellijnen hebben een voorkeur voor licht basische pH-waarden tussen 7,4 en 7,7. Insecten-cellijnen zoals Sf9 en Sf21 hebben een pH-optimum van 6,2.

Bij de pH-waarde bestaat een gevoelig evenwicht tussen de opgeloste CO2 en bicarbonaat HCO3-concentratie in de voedingsbodem en de CO2-concentratie in de atmosfeer. Daarvoor zijn de voedingsbodems gebufferd, bijvoorbeeld met het organische HEPES of een buffer op CO2-bicarbonaatbasis. Schommelingen in de atmosferische CO2-concentratie leiden tot ongewenste wijzigingen van de pH-waarde in de celcultuur. Daarom wordt in de CO2-broedstoven, afhankelijk van de celcultuur, een kooldioxideconcentratie tussen 5 en 7 vol. % gehandhaafd.

Enkele fabrikanten van CO2-incubatorengeven in hun gebruikershandleidingen nuttige informatie over de afhankelijkheid tussen de pH-waarden in voedingsbodems en de CO2-concentratie in de broedstoof.

Cultureel media-overzicht

Voorbeeld: Als een pH van 7,2 in een voedingsbodem wordt gemeten die met 2,20 g NaHCO3 per liter wordt gebufferd,bedraagt de CO2-concentratie in de omgeving van de voedingsbodem 8 vol.-%.

De CO2-concentratie in incubatoren wordt ofwel met een IR-sensor (infraroodsensor) of met een WLD-sensor (warmte-geleidbaarheidssensor) gemeten.

Normoxie, Hypoxie en Hyperoxie 

De zuurstofconcentratie in de lucht bedraagt 21 vol. % (normoxie). Vetweefsel heeft echter een zuurstofconcentratie van circa tien tot vijftien procent en de zuurstofconcentratie van beenmerg bedraagt ongeveer zes tot zeven procent. Voor gevoelig weefsel zoals de longen of het netvlies zijn hyperoxische condities nodig (21-90 vol.%).

Om zuurstofconcentraties onder en boven de 21 vol.% te bereiken zijn CO2/O2-incubatoren nodig. Meer informatie hierover vindt u ook in onze blogpost over normoxie en hypoxie.

Temperatuur en luchtvochtigheid

Alle cellulaire processen zijn afhankelijk van de temperatuur. Celculturen van zoogdieren bereiken een optimale temperatuur bij 37°C, terwijl celculturen van insecten, vissen en amfibieën meestal 25 tot 28°C nodig hebben.

Hoge vochtigheidswaarden in CO2-incubatoren reduceren de verdampingssnelheid in de voedingsbodems tot een minimum en behouden zo de gewenste osmotische concentratie
(of modulariteit).

Voor de temperatuurregeling en de bevochtiging van CO2-incubatoren zijn er verschillende mogelijkheden beschikbaar.

Een hoogwaardige CO2-broedstoof voor ieder celtype ideale groeicondities:

Meer informatie over de celcultivering vindt u hier!

WHITEPAPER CELCULTIVERING IN CO2-INCUBATOREN

Van binnenkamerfactoren zoals temperatuur, CO2-gehalten, zuurstofgehalte of vochtigheid tot aan incubatormaterialen, reiniging en broedstoofvalidatie: een doordacht incubatorconcept omvat, controleert en regelt vele verschillende parameters. Bij de weefselcultivering in de CO2-incubator is ieder criterium belangrijk. Bepaalde instelwaarden zijn voor de celculturen zelfs van vitaal belang. 

Celbroedstoven worden daarom continu kwalitatief doorontwikkeld om concrete doelen te bereiken:

  • voldoen aan instelwaarden
  • hoogste precisie
  • consistentie
  • controleerbaarheid
  • regelbaarheid
  • eenvoud
Whitepaper celcultuur

Mijn gegevens

Schoon werken in laboratoria

Goede celgroei is het doel van ieder celcultuurlaboratorium. Dat betekent ook de consequente eliminatie en beheersing van de contaminatierisico's die door bacteriën, gist, schimmels, mycoplasma's en door kruiscontaminaties ontstaan. Contaminatiebronnen kunnen zijn: celculturen, apparaten, oppervlakten, voedingsbodems, reagentia en pathogenen die zich via de lucht verspreiden. De grootste contaminatiebron is echter de mens.

Goed dat laboratoriummedewerkers een grote bijdrage kunnen leveren aan het vermijden van contaminatie. Protocollen, Standard Operation Procedures (SOP), controlelijsten en een continu verbeteringsproces zijn de voorwaarden daarvoor. Daarbij moet rekening worden gehouden met zeven aspecten: persoonlijke werkhygiëne, laboratoriumapparatuur, hulpmiddelen, werkplekken, reagentia, voedingsbodems en hantering. Hier slechts enkele tips:

1. Persoonlijke werkhygiëne

Was uw handen voor en na het werken met celculturen om het risico op contaminaties of kruiscontaminaties te verlagen. Draag veiligheidskleding zoals handschoenen, haarnetje, laboratoriumjas, mondbescherming en overschoenen. Horloges, ringen en mobiele telefoons zijn mogelijke contaminatiebronnen.

Voordat u de glasdeur van een CO2-incubator opent, dient u zich ervan te vergewissen waar het kweekbakken die u nodig heeft zich bevinden. Daarop moet de glasdeur behoedzaam worden geopend, de kweekbakken snel eruit gehaald of teruggeplaatst worden. Vervolgens moet de glasdeur en buitendeur worden gesloten.

2. Laboratoriumapparatuur, Hulpmiddelen en Werkplekken

Het werkblad van een veiligheidswerkbank moet minimaal één keer per dag worden gereinigd. De gehele binnenruimte waarin wordt gewerkt minimaal één keer per week. Uv-lampen en HEPA- of ULPA-filters moeten op tijd worden vervangen.

CO2-incubatoren kunnen met verschillende methoden worden gesteriliseerd. Betrouwbaar, reproduceerbaar en efficiënt is een heteluchtsterilisatie bij 180 °C. Ook de waterschaal moet regelmatig worden gereinigd en de incubator moet op basis van de SOP worden behandeld. Gedeelde binnendeuren gaan het binnendringen van contaminaties tegen.

Werkplekken moeten regelmatig met 70% ethanol worden gereinigd. Gemorste vloeistoffen moeten meteen worden opgeruimd.

3. Reagentia, Voedingsbodems en Hantering

Steriele reagentia en voedingsbodems worden door onjuiste hantering en opslag gecontamineerd. Een voorzichtige omgang en toepassing van de juiste sterilisatiemethoden zoals autoclaaf een en steriele filters verlagen het contaminatierisico.

Celflesjes in de incubator

4. CO2-Incubatoren 

Het principe ‘Less is more’ bij CO2-incubatoren omvat vele constructieve eigenschappen die garant staan voor een goede groei en het contaminatierisico tegengaan, bijvoorbeeld ronde hoeken in de incubatiekamer zonder lasnaden, onnodige inbouwelementen, bijv. voor de luchtgeleiding in de incubator, geen ventilatoren of HEPA-filters in de binnenkamer.  Het belangrijkste vindt u ook in onze Buyer’s Guide voor CO2-incubatoren.

Conclusie

Organs-in-a-dish, in vitro gekweekte voedingsmiddelen en innovatieve therapieën – wie weet wat celculturen nog allemaal mogelijk maken. Terwijl de celcultuur zich continu doorontwikkelt, worden ook onze CO2-incubatoren doorontwikkeld.

Daarvoor heeft onze CB 170 enkele fascinerende nieuwe oplossingen, zoals een nieuwe IR-sensor, kleinere buitenafmetingen bij tegelijk grotere binnenkamer, DuoDoor™ – een nieuwe, slimme oplossing voor de deurbediening en de innovatieve nieuwe optie voor een snelle toegang tot de monsters.

Gehandhaafd hebben wij de beproefde 180°C heteluchtsterilisatie voor de volledige sterilisatie van de hele binnenkamer die nu de gouden standaard is geworden, de roestvaststalen binnenkamer zonder lasnaden en het gepatenteerde vochtmanagement.

U wilt kennismaken met onze CO2-incubatoren? Wij adviseren u graag!

Mijn gegevens