Die hohe Kunst der Zellkultivierung

Auf dieser Wissensseite wird eine Auswahl von Zellkulturarten, Parametern und Geräten für eukaryotische Zellkulturen aus Vertebraten und Invertebraten betrachtet. Kurz erwähnt werden pflanzliche Zellkulturen, z. B. von Arabidopsis.

Kulturen aus prokaryotischen Lebewesen, welche typischerweise in mikrobiologischen Inkubatoren kultiviert werden, sind nicht Teil dieses Beitrags.

Pharmazeutische Forschung, medizinische Forschung, Reproduktionsmedizin (IVF), Regenerationsmedizin (Transplantate, Prothesen, Tissue Engineering) und und und. In den weltweiten Zellkulturlabors werden verschiedene Zellkulturen eingesetzt, um die unterschiedlichsten Aufgaben zu erfüllen.

Zellkulturen im Überblick

An dieser Stelle erscheint uns folgende Klärung der Begriffe „unter Glas oder im Reagenz-glas“ (in vitro) und „außerhalb des Lebenden“ (ex vivo) hilfreich.

Wir benutzen den Begriff „in vitro“ für Zell- und Gewebekultur außerhalb des Organismus unter künstlichen physiologischen Bedingungen. Typischerweise in Zellkulturgefäßen, -platten und -schalen, mit Nährmedien z. B. RPMI-1640, DMEM oder Ham’s F-12 und bei simulierter Temperatur und Feuchte in CO2-Inkubatoren resp. CO2/ O2-Inkubatoren. Solche Kulturen können, wie im Falle der immortalisierten HeLa-Zelllinie, zeitlich unbegrenzt bestehen.

Ex vivo bezeichnet Vorgänge, bei denen lebendes Material, z. B. Blut zur Behandlung entnommen wird und nach der Kultur in einem CO2-Inkubator dem Körper zeitnah zurück-geführt wird. So werden z. B. bei der ex-vivo-Gentherapie Gene in Zellen eingeschleust.

1. Primärkulturen, Zelllinien und Zellstämme

Primärkulturen entstehen aus Zellen, Geweben oder Organen, welche direkt aus einem Organismus entnommen wurden.

Nach der ersten Subkultur (Sekundärkultur) bzw. dem ersten Passagieren entsteht eine Zelllinie deren limitierte Lebensdauer nicht zuletzt dem natürlichen Alterungsprozess der lebenden Organismen entspricht.

Primärkulturen aus normalem Gewebe brauchen ein festes Substrat für die Anheftung (adhärente Kulturen), während Tumorzellen in Suspension kultiviert werden können.

Die von einer Primärkultur oder Zelllinie durch Selektion oder Klonierung abgeleiteten Zellen mit spezifischen Eigenschaften nennt man Zellstamm.

2. Immortalisierte Zellen

Die Möglichkeit zur unbegrenzten Zellteilung zeichnet immortalisierte Zellen aus. Diese „Unsterblichkeit“ entsteht entweder durch Infektion mit Viren, z. B. durch das Papillomavirus HPV18 (HeLa-Zellen), durch Transfektion mit immortalisierten Genen oder Proteinen sowie durch die Hybridom-Technik. Hierbei werden antikörperproduzierende B-Zellen mit Myelomzellen (Tumorzellen) fusioniert um monoklonale Antikörper zu produzieren.

Eine der berühmtesten permanenten Zelllinien ist die HeLa-Zelllinie. Sie wurde in den 50er Jahren aus dem Cervixkarzinom der Amerikanerin Henrietta Lacks extrahiert: das erste Mal, dass aus einer menschlichen Zelle eine immortalisierte Zelllinie gewonnen wurde. Über 50 Tonnen HeLa-Zellen wurden seither in den weltweiten Laboren gezüchtet. Die Wissenschaft verdankt der robusten HeLa-Zelle zigtausende Experimente und Ergebnisse.

Dabei ist die HeLa-Zelllinie nicht die einzige permanente Zelllinie, die sich in der Forschung etabliert hat. Inzwischen umfasst die Liste verfügbarer humaner und tierischer Zelllinien über 4.000 Eintragungen. Darunter die Vero-Zellen (African Green Monkey-Zelllinie), die HEK-293-Zellen (Human Embryonic Kidney-Zelllinie) und die K562-Zellen (älteste menschliche Leukämie-Zelllinie).

3. Adhärente Zellen und Suspensionskulturen

Adhärente Zellen wie z. B. HEK 293 und CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellkulturen wachsen und vermehren sich nur, wenn sie sich an der Oberfläche von Kulturgefäßen anheften können.

Als zweidimensionale Zellkultur breiten sie sich auf ihrer Unterlage so lange als ein-zellige Schicht (Monolayer) aus, bis es zur Zellkontakthemmung (Konfluenz) und schließlich zum Absterben der Kultur kommt. In CO2-Inkubatoren werden deshalb zur Vergrößerung der Wachstumsfläche Rollerflaschen eingesetzt. Schüttler werden ebenfalls eingesetzt um die Wachstumsbedingung der adhärenten Zellkulturen zu verbessern. Beide Möglichkeiten dienen einem scale-up. Um Kulturen in der log-Phase zu halten ist regelmäßiges Passagieren (das Überführen in neue Kulturgefäße mit frischem Nährmedium) notwendig.

Suspensionskulturen oder nicht-adhärente Kulturen sind tierische, menschliche oder pflanzliche Zellen, die sich in flüssigem Nährmedium ohne Anheften an das Kulturgefäß vermehren. Nur wenige Zellarten sind für eine Suspensionskultur geeignet, z. B. NS0-Zellen (mouse myeloma), welche sowohl in der biomedizinischen Forschung als auch in der Produktion von therapeutischen Proteinen eingesetzt werden. In CO2-Inkubatoren erfolgt das scale-up von Suspensionskulturen z. B. in Spinnerflaschen  oder Rotationsschüttlern.

4 Pflanzenzellkulturen

Pflanzenzellen können ebenfalls in vitro kultiviert werden. Die Kulturen entstehen aus Explantaten von Blättern, Sprossachsen, Knollen, Fruchtknoten, Antheren oder Wurzeln. Bei photosynthetisch aktiven Kulturen muss sichergestellt werden, dass eine adäquate Beleuchtungsstärke und ein geeignetes Lichtspektrum vorhanden ist, z. B. in Pflanzenwuchsschränken mit Wachstumsleuchten vom Typ Fluora® oder vom Typ Arabidopsisleuchte. In Pflanzenwuchsschränken werden auch Rollerflaschen, z. B. zum scale-up, sowie Rotationsschüttler eingesetzt.

Einige Bezugsquellen

Der Bedarf wächst

Verschiedene Marktanalysen weisen für den weltweiten Zellkulturmarkt ein starkes Wachstum zwischen $30 und $35 Milliarden bis zum Jahre 2023 aus.  Berücksichtigt wurden dabei Anwendungsbereiche, z. B. pharmazeutische Industrie, Biotechnology, Krebsforschung und Tissue Engineering, Laborgeräte wie Autoklaven, Bioreaktoren, Zentrifugen und Filtrationssysteme, sowie Verbrauchsmaterialien wie Serum-freies Medium und Antibiotika.  Allein der Markt für 3D-Zellkulturen soll bis 2019 auf über $2 Milliarden wachsen.

Im Vergleich zu den beschriebenen 2D-Kulturen zeigen 3D-Zellkulturen eine größere Ähnlichkeit mit den morphologischen, metabolischen und funktionellen Merkmalen in vivo.  Dabei lassen sich 3D-Kultursysteme in matrixgestützte und matrixfreie Systeme einteilen. Diese verfügen über ein einzigartiges Potenzial als Test- und Forschungssystem für medizinische und pharmazeutische Untersuchungen.  So gibt es 3D-Tumormodelle, 3D-Hautmodelle, 3D-Darmmodelle und 3D-Lebermodelle.

3D-Zellkultursysteme werden eingesetzt bei der Arzneimittelentwicklung, der biologischen und medizinischen Forschung, in den Bereichen Regenerative Medizin und Tissue Engineering, der Umweltanalytik und als Ersatz von Tierversuchen.

Biopharmazeutika besitzen ebenfalls ein enorm großes wirtschaftliches Potenzial.

Immer zahlreicher werden die biopharmazeutischen Wirkstoffe, die mit Hilfe von Säugetierzellen produziert werden, wie z. B. das Brustkrebsmedikament Herceptin aus CHO-Zelllinien.  Dazu werden große Bioreaktoren bzw. Fermentationstanks eingesetzt.  In Fermentern mit über 10.000 Liter Volumen entstehen i.d.R. nur wenige Kilogramm des Wirkstoffes.

Eines der erfolgreichsten Beispiele für die Zellkultivierung im großen Maßstab ist die Produktion von Epoetin α und β (Erythropoetin-EPO) durch einen genetisch modifizierten Subklon einer CHO-Zelllinie.  EPO ist ein menschliches, für die Bildung roter Blutzellen wichtiges Eiweißhormon, das die Ärzte vor allem Krebs- und Nierenpatienten verschreiben. Mit einem Jahres-Umsatz von rund zehn Milliarden Euro ist es das führende Biopharmazeutikum weltweit. 

Auch monoklonale Antikörper, die alle aus einer einzigen Ursprungs-B-Zelle stammen und daher identisch und sehr spezifisch sind, lassen sich in großer Menge im CO2-Inkubator züchten. In der Medizin werden sie sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie genutzt.

Zellkulturlabor, die Laborgeräte und Hilfsmittel

Beginnend mit der Laborplanung, der Laboreinrichtung, der Ausstattung mit Laborgeräten, Kulturgefäßen, Nährmedien bis hin zur Pipette gilt es den Produktschutz, Personenschutz und Umweltschutz zu beachten genauso wie die Vorgaben der GLP bzw. GMP.

Die hohe Kunst der Zellkultivierung

Laborplanung und Laborausstattung

Biologische Sicherheitswerkbänke und CO2-Inkubatoren sollten in unmittelbarer Nähe zueinander stehen. Die Türen des CO2-Inkubators sollten sich zum Arbeitsplatz hin öffnen. Dies ist besonders beim Passagieren hilfreich, da die Entnahme und Beladung der Kulturgefäße zügig und auf kürzestem Weg stattfinden kann.

Wichtig ist auch die Wahl des richtigen Aufstellungsorts im Labor. So sollte direkte Sonneneinstrahlung auf Laborgeräte genauso vermieden werden wie Aufstellungsorte mit starken Luftbewegungen, z. B. in der Nähe von Türen oder unter Deckenklimaanlagen. Ferner sollte man die Herstellervorgaben zu den allseitigen Wandabständen unbedingt einhalten. Es versteht sich von selbst, dass alle Laborgeräte mit einer Wasserwaage ausgerichtet werden.

Weitere Geräte in einem Zellkulturlabor sind z. B. Zentrifugen, Kühlschränke, Freezer, Zellzähler, Kryostate, Mikroskope, Pipetten und Pipettenhalter.

Zellkultivierung im Inkubator

Hilfsmittel

Kulturgefäße

Petrischalen, T-Flasks, Mikrotiterplatten, z. B. gemäß SLAS Standards (Society For Laboratory Automation And Screening, ehemals SBS-Standard) für Screenings (HTS in der Wirkstoffforschung), Folien für 3D-Zellkulturen und Rollerflaschen stellen nur eine kleine Auswahl möglicher Kulturgefäße für die Zellkultivierung von adhärenten und Suspensionskulturen oder hängenden Tropfen-Zellkulturen dar.

Nährmedien

Nährmedien sind besonders wichtig in der Zellkultur, da sie die notwendigen Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und Hormone liefern, aber auch eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des pH-Werts und des osmotischen Drucks spielen. Es gibt drei Arten von Medien: Basal Medium Eagle (BME), Serum-reduziertes und Serum-freies Medium, z. B. für Hybridoma, CHO, Keratinozyten und Insektenzellen.

Weitere Beispiele sind: RPMI-1640, Dulbecco’s Modified Eagle Medium oder Ham's F12. Zum Waschen und zur kurzfristigen Lagerung (wenige Minuten) werden Balanced Salt Solutions wie Hanks-Salze oder Earle-Salze verwendet.

Überlebenswichtige Parameter

pH-Wert und CO2-Konzentration

Die meisten Säugetierzellen fühlen sich bei einem pH von 7,4 recht wohl. Transformierte Zelllinien bevorzugen leicht saure pH-Werte zwischen 7,0 und 7,4, während normale Fibroblasten-Zelllinien leicht basische pH-Werte zwischen 7,4 und 7,7 bevorzugen. Insektenzelllinien wie z. B. Sf9 und Sf21 haben ein pH-Optimum von 6,2.

Beim pH-Wert besteht ein empfindliches Gleichgewicht zwischen dem gelösten CO2 und Bikarbonat HCO3- im Medium und der CO2-Konzentration in der Atmosphäre. Dazu sind Medien gepuffert, z. B. mit dem organischen HEPES oder einen CO2-Bikarbonatbasierten Puffer. Schwankungen in der CO2-Konzentration der Atmosphäre führen zu unerwünschten Änderungen des pH-Werts in der Zellkultur. Deshalb wird in CO2-Brutschränken, je nach Zellkultur, eine Kohlendioxidkonzent-ration zwischen 5 und 7 Vol. % aufrechterhalten.

Einige Hersteller von CO2-Inkubatoren bieten in ihren Bedienungsanleitungen nützliche Informationen zur Abhängigkeit der pH-Werte in Medien von der CO2-Konzentration im Brutschrank.

Kulturmedien Überblick

Beispiel: Wenn ein pH von 7,2 in einem Medium gemessen wird, das mit 2,20 g NaHCO3 pro Liter gepuffert wird, beträgt die CO2 Konzentration in der Umgebung des Mediums 8 Vol.-%.

Die CO2-Konzentration in Inkubatoren wird entweder mit einem IR-Sensor (Infrarotsensor) oder einen WLD-Sensor (Wärmeleitfähigkeitsdetektor) gemessen.

Normoxie, Hypoxie und Hyperoxie 

Die Sauerstoffkonzentration der Luft beträgt 21 Vol.% (Normoxie). Fettgewebe weist aber eine Sauerstoffkonzentration von etwa zehn bis fünfzehn Prozent auf, beim Knochenmark liegt diese bei etwa sechs bis sieben Prozent. Dahingegen benötigen empfindliche Gewebe wie Lunge oder Retina hyperoxische Bedingungen (21-90 Vol.%).

Um Sauerstoffkonzentrationen unter und über 21 Vol.% zu erzielen, sind CO2/O2-Inkubatoren erforderlich. Mehr Informationen finden Sie dazu auch in unserem Blogbeitrag über Normoxie und Hypoxie.

Temperatur und Luftfeuchtigkeit

Alle zellulären Prozesse sind temperaturabhängig. Säugetierzellkulturen haben ihr Temperaturoptimum bei 37°C, während Zellkulturen von Insekten, Fischen und Amphibien meist 25 bis 28°C benötigen.

Hohe Feuchtewerte in CO2-Inkubatoren reduzieren die Verdunstungsraten in den Nährmedien auf ein Minimum und erhalten somit die gewünschte osmotische Kon-zentration (Osmolarität).

Für die Temperierung und Befeuchtung von CO2-Inkubatoren gibt es verschiedenen Möglichkeiten.

Ein hochwertiger CO2-Brutschrank bietet jedem Zelltyp ideale Wachstums-Bedingungen:

Mehr Informationen zur Zellkultivierung erhalten Sie hier!

Whitepaper Zellkultivierung im CO2-Inkubator

Von Innenraumfaktoren wie Temperatur, CO2-Gehalt, Sauerstoffgehalt oder Feuchte über die Inkubator-Materialen und ihre Reinigung bis hin zur Brutschrank-Validierung: Ein durchdachtes Inkubator-Konzept umfasst, kontrolliert und regelt viele unterschiedliche Parameter. Jedes Kriterium spielt bei der Gewebekultivierung im CO2-Inkubator eine Rolle. Mancher Soll-Wert ist für Zellkulturen sogar überlebenswichtig. 

Zell-Brutschränke wurden deshalb qualitativ stetig weiterentwickelt, um konkrete Ziele zu erreichen:

  • Soll-Wert-Erfüllung
  • höchste Präzision
  • Konstanz
  • Kontrollierbarkeit
  • Regulierbarkeit
  • Unkompliziertheit
Zellkultivierung im CO2-Inkubator

Meine Angaben

Sauberes Arbeiten im Labor

Gutes Zellwachstum ist das Ziel jedes Zellkulturlabors. Das bedeutet auch konsequente Eliminierung und Beherrschung der Kontaminationsrisiken, die durch Bakterien, Hefen, Pilze, Mycoplasmen und durch Kreuzkontaminationen entstehen. Kontaminationsquellen können kontaminierte Zellkulturen, Geräte, Oberflächen, Medien, Reagenzien sowie Luftkeime sein. Die größte Kontaminationsquelle ist aber der Mensch.

Gut, dass Labor-Mitarbeiter viel zur Kontaminationsvermeidung beitragen können. Protokolle, Standard Operation Procedures (SOP), Checklisten und ein gelebter kontinuierlicher Verbesserungsprozess sind Voraussetzungen dafür. Dabei gilt es sieben Aspekte zu berücksichtigen: persönliche Arbeitshygiene, Laborgeräte, Hilfsmittel und Arbeitsplätze, Reagenzien und Medien sowie das Handling. Hier nur einige Tipps:

1. Persönliche Arbeitshygiene

Waschen Sie Ihre Hände vor und nach der Arbeit mit Zellkulturen um das Risiko von Kontaminationen bzw. Kreuzkontaminationen zu verringern. Tragen Sie Schutzbekleidung wie Handschuhe, Haarnetz, Laborkittel, Mundschutz und Schuhüberzieher. Armbanduhren, Ringe und Handys sind potentielle Kontaminationsquellen. 

Vor dem Öffnen der Glastür eines CO2-Inkubators sollten Sie sich vergewissern, wo das zu entnehmende Kulturgefäß ist. Die Glastür sollten Sie dann behutsam öffnen, die Kulturgefäße zügig entnehmen oder einbringen um dann die Glastür und die Außentür zu schließen.

2. Laborgeräte, Hilfsmittel und Arbeitsplätze

Die Arbeitsfläche einer Sicherheitswerkbank sollte mindestens einmal täglich gerei-nigt werden, der gesamte Arbeitsinnenraum mind. einmal die Woche. Der Aus-tausch von UV-Strahlern und HEPA resp. ULPA-Filtern sollte rechtzeitig erfolgen.

CO2-Inkubatoren können durch verschiedene Verfahren sterilisiert werden. Zuver-lässig, reproduzierbar und effizient ist eine Heißluftsterilisierung bei 180°C. Die Wasserschale sollte regelmäßig gereinigt werden, der Inkubator entsprechend der SOP. Geteilte Innentüren wirken dem Eindringen von Kontaminationen entgegen.

Arbeitsplätze sollten regelmäßig mit 70% Ethanol gereinigt werden. Verschüttetes sollte sofort beseitigt werden.

3. Reagenzien, Medien und Handling

Sterile Reagenzien und Medien werden durch unsachgemäße Handhabung und Lagerung kontaminiert. Achtsamer Umgang und Verwendung entsprechender Sterilisationsmethoden, z. B. Autoklaven und Steril-Filter verringern die Kontaminationsgefahr.

Zellflaschen im Inkubator

4. CO2-Inkubatoren 

Das „Less is more“-Prinzip bei CO2-Inkubatoren umfasst eine Vielzahl an konstruktiven Merkmalen, die gutes Wachstum sicherstellen und der Kontaminationsgefahr entgegen-wirken, z. B. abgerundete Ecken in einem Inkubationsraum ohne Schweißnähte, Verzicht auf unnötige Einbauten wie z. B. zur Führung der Luft im Inkubator, Verzicht auf Ventilatoren und HEPA-Filter im Innenraum.  Worauf es noch ankommt finden Sie auch in unserem Buyer’s Guide für CO2-Inkubatoren.

Fazit

Organs-in-a-dish, in vitro gezüchtete Nahrungsmittel und neuartige Therapieansätze - wer weiß, was die Zellkultur als nächstes möglich macht. So wie sich die Zellkultur immer weiter entwickelt, entwickeln sich auch unsere CO2-Inkubatoren weiter.

Dazu hat unser neuer CB 170 einige tolle neue Lösungen, z. B. einen neuen IR-Sensor, verkleinerte Außenmaße bei gleichzeitig vergrößertem Innenraum, DuoDoor™ - eine neue smarte Lösung für die Türbedienung und die innovative neue Option Probenschnellzugriff.

Beibehalten haben wir die bewährte 180°C Heißluftsterilisation zur vollständigen Sterilisation des gesamten Innenraums, welcher nun der Goldstandard ist, den Edelstahl-Innenraum ohne Schweißnähte sowie das patentierte Feuchtemanagement.

Sie wollen unsere jüngsten CO2-Inkubatoren kennenlernen? Wir beraten Sie gerne!

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